麦角菌HCB?01712生物合成香草酸甲酯
【摘要】 从麦角菌(Claviceps sp.)HCB?01712的发酵液中分离纯化得到化合物HCB?01712?2，经理化分析、紫外吸收、质谱及核磁共振谱分析，确定该化合物为香草酸甲酯。微生物发酵产生香草酸甲酯未见报道。本研究首次从麦角菌发酵代谢产物中发现香草酸酯，有望替代昂贵的植物来源而成为安全的天然绿色产品。
【关键词】 麦角菌 生物合成 香草酸甲酯 纯化鉴别
Methyl vanillate produced by Claviceps HCB?01712
ABSTRACT The compound HCB?01712?2 has been isolated from the broth of Claviceps HCB?01712, by the analyses of its physico?chemical properties, UV, ESI?MS and NMR spectra data, the structure of HCB?01712?2 has been identified as methyl vanillate. It is the first report of methyl vanillate produced by microorganisms.
KEY WORDS Claviceps; Biosynthesis; Methyl vanillate; Purification and identification
香草酸酯类(如香草酸甲酯及香草酸乙酯)是一类用途十分广泛的香料，不仅可作为香水、护肤护发品、化妆品、理发用品、空气清新剂、止汗露及房屋除臭剂等化工产品的添加剂［1］，还可作为许多食品的调味剂，是食品、烟草、调味品和日化香精的很好定香剂。香草酸甲酯还是合成很多药物和化工产品的原料和前体物质。目前，绝大多数香草酸甲酯来源于化学合成，少量取自植物，香草酸甲酯也是许多葡萄酒的主要挥发性香味成分，是酿酒酵母［2］或其它细菌［3］将葡萄中含有的香草酸甲酯葡萄糖苷类物质水解后释放出来的重要香味成分。本研究从12株不同麦角菌(Claviceps sp.)中分离选育，得到一株麦角菌HCB?01712，它能产生化合物HCB?01712?2，该化合物经紫外、质谱及核磁共振分析，确定其化学结构为香草酸甲酯。微生物发酵生产香草酸甲酯未见报道。本文报道其发酵、分离纯化和结构鉴定。
1 材料与方法
1.1 菌种及其制备
菌种 麦角菌(Claviceps)HCB?01712，上海来益生物药物研发中心提供。
斜面(%) 马铃薯提取物20，葡萄糖2，酵母粉0.15，琼脂2，pH6.0。
种子培养基(%) 蔗糖1.5，柠檬酸三钠0.25，CaCl2·2H2O 0.1，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.02,酵母粉0.01，NH4NO3 0.2，FeSO4·7H2O 0.0007，ZnSO4·7H2O 0.0006，氨水调pH至6.1。
发酵培养基(%) 蔗糖30，柠檬酸1.5，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.05， 酵母粉0.01，KCl 0.012，FeSO4·7H2O 0.0007，ZnSO4·7H2O 0.0006，氨水调pH至5.2。
采用二级发酵，将冷冻管接种于斜面培养基，24℃培养4～6d，以孢子悬液形式接种于种子培养基，24℃培养4d，转接于发酵培养基，24℃培养7d。
1.2 设备与仪器
N?1001型旋转蒸发仪由上海爱朗仪器有限公司生产；核磁共振仪Varian?Inova?400；质谱仪Q?Tof micro YAO19；紫外及HPLC使用Agilent公司DE11108479泵和DAD检测器。柱层析硅胶为山东黄海化学试剂厂产品，薄层层析板为Merck公司生产的GF254硅胶板。所用试剂为分析纯。香草酸甲酯标准品为Across公司生产的methyl vanillate(≥99%)。
2 结果与讨论
2.1 发酵提取和样品制备
取麦角菌HCB?01712菌丝浸泡液经旋转蒸发仪(N?1001型)浓缩，以丙酮∶石油醚(10∶1)溶解，拌入适量硅胶(200～300目)，干燥后装入已用石油醚∶丙酮(100∶1)预先平衡好的硅胶柱中，用石油醚∶丙酮(10∶1)系统恒定洗脱，分部收集，每个流分约10ml，收集合并第18～21流分，浓缩蒸干，得到HCB?01712?2粗品Ⅰ。
发酵上清液用乙酸乙酯萃取，所得萃取相经旋转蒸发仪(N?1001型)浓缩，得浓缩液。将浓缩液直接上硅胶层析柱，以石油醚∶丙酮(50∶1)，石油醚∶丙酮(10∶1)以及石油醚∶丙酮(9∶1)进行梯度洗脱，分部收集，每个流分约10ml，合并第6～23流分，经浓缩结晶得到HCB?01712?2粗品Ⅱ。
将HCB?01712?2粗品Ⅰ和Ⅱ合并，得到粗品Ⅲ，将粗品Ⅲ加入已用石油醚∶丙酮(100∶1)预先平衡好的硅胶柱(40cm×1.5cm)中进行第二次层析分离，梯度洗脱，洗脱系统为石油醚∶丙酮(100∶1)，石油醚∶丙酮(50∶1)，石油醚∶丙酮(40∶1)；收集第16～22馏分，合并浓缩后得到黄色油状物质(样品Ⅳ)，经HPLC分析，HCB?01712?2的纯度在95%以上。
样品Ⅳ经制备高效液相进一步纯化，浓缩干燥得白色固体，供精密波谱分析和化学结构确定，其HPLC纯度分析见Fig.1。
2.2 HCB?01712?2的理化性质
该化合物为白色粉末，易溶于乙醇或丙酮等有机溶剂，难溶于甲醇，不溶于水，结果见Tab.1。
2.3 结构解析
(1)紫外吸收特征 HCB?01712?2化合物的紫外吸收波长为220、 265和295nm(Fig.2)， 其中220nm吸收值最大，与标准品香草酸甲酯的特征吸收一致。
(2)ESI?MS检测结果 根据ESI?MS图中183.09(M+H)和205.07(M+Na)峰，可判定该化合物分子量为182。该分子量与香草酸甲酯的分子量相同。
(3)NMR分析结果 HCB?01712?2的1H?NMR图中有3个烯氢质子δ7.55(1H，d)、6.93(1H，d)和7.63(1H，dd)，依次对应于2、5和6位碳；2个甲基δ3.88(3H，s)和3.94(3H，s)含有6个碳甲基质子，分别对应于8和9位碳；4位碳上的羟基质子对应于δ5.96(1H，bs)(Tab.2)。结果与香草酸甲酯的结构相符。
HCB?01712?2的13C?NMR(400MHz，CDCl3)谱中含有9个碳原子，其中有2个甲基碳原子δ51.85和56.18，4个烯碳原子δ122.45、111.91、114.12和124.28， 1个羰基碳原子δ166.83和1个连氧碳原子结果与香草酸甲酯相一致。
2.4 HCB?01712?2化合物结构确定
根据理化性质、紫外、质谱、氢谱和碳谱以及碳氢相关谱的综合分析，并参照报道数据进行对比，确定HCB?01712?2化合物为香草酸甲酯(Fig.3)。
3 讨论
麦角菌(Claviceps sp.)是麦角生物碱的产生菌，在研究麦角菌HCB?01712产生麦角碱的过程中发现该菌能够产生香草酸甲酯。香草酸甲酯是一类应用十分广泛的香料。目前国内、外主要采用化学合成的方式取得香草酸甲酯，化学合成的方法存在如下问题：①原Fig.3 The structure of HCB?01712?2 (methyl vanillate)
料香草酸或香草醛的成本较高；②操作过程复杂，需要使用大量的浓硫酸，安全性低；③样品的得率低、纯度不够；④随着各国对食品卫生的重视和管理在加强，近年来各国商标法中对食品添加剂的某些限制性规定日益明确，使化学合成食品添加剂的使用受到限制［5］。另一方面，人们对化学合成的食品添加剂存在抵触乃至恐惧心理，人们宁可花高于化学合成产品几十倍甚至几百倍的价钱购买天然安全的“绿色产品”。尽管香草酸甲酯还可以从植物中提取，但由于植物来源有限，处理过程困难，导致了植物来源的香草酸甲酯价格十分昂贵。
本研究首次从微生物的代谢产物中发现香草酸甲酯。微生物来源的香草酸甲酯，是典型的安全天然绿色产品，且制造成本低，有望开辟出全新的香草酸甲酯制造业。
【文献】
［1］ Crochemore M, Storet I. Vanillic acid ester perfuming agents ［P］. US5686406,1997?11?11
［2］ Ferniandez?Gonzialez M, Di Stefano R. Fractionation of glycoside aroma precursors in neutral grapes. Hydrolysis and conversion by Saccharomyces cerevisiae ［J］. Lebensm Wiss.u Technol,2004,37:467
［3］ D′Incecco N, Bartowsky E J, Kassara S, et al. Release of glycosidically bound flavour compounds of Chardonnay by Oenococcus oeni during malolactic fermentation ［J］. Food Microbiol,2004,21:257
［4］ Wilson S C, Howard P W, Forrow S M, et al. Design, synthesis, and evaluation of a novel sequence?selective epoxide?containing DNA cross?linking agent based on the pyrrolo ［2,1?c］［1,4］benzodiazepine system［J］. J Med Chem,1999,42:4028
［5］ 李永红，郑璞，孙志浩. 生物技术方法生产香草醛研究进展［J］. 微生物，2004，34(4)：46
