纳他霉素产生菌基因组重排育种
【摘要】 Streptomyces gilvosporeus SG?1原生质体经紫外线诱变并筛选链霉素抗性菌株，获得纳他霉素高产菌株。在上述高产突变株中选择4株作为亲本进行基因组重排育种，筛选得到了高产重排菌株，其中一株重排菌株S.gilvosporeus GS?74的纳他霉素产量为3574mg/L，为产量最高的亲本菌株的153%，比原始出发菌株SG?1提高1.17倍。
【关键词】 纳他霉素 褐黄孢链霉菌 基因组重排
Natamycin?producing strain breeding by genome shuffling
ABSTRACT After isolating the protoplasts of Streptomyces gilvosporeus SG?1, they were mutated with UV irradiation, the streptomycin resistance mutants were screened, and the high natamycin producing strains were obtained. Among them, 4 strains with high natamycin production were selected as parent strains for genome shuffling. Consequently a high natamycin yeilding strain, S.gilvosporeus GS?74, was obtained, whose natamycin productiion reached 3574mg/L that was 153% of the parents strains and higher by 1.17 times than that of the starting strain.
KEY WORDS Natamycin; Streptomyces gilvosporeus; Genome shuffling
由纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chatanoogensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)等产生菌发酵生成的纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱的抗真菌剂，能有效地抑制酵母和霉的生长，阻止丝状真菌中真菌毒素的形成［1］。美国食品及药物管理局(FDA)和我国卫生部先后于1982和1997年正式批准纳他霉素作为食品添加剂。由于纳他霉素具有毒性低、对产品口感特性无影响等特点，已在乳制品、肉类、水果、饮料等食品中得到广泛的应用［2］。
20世纪90年代中、 后期崛起的基因组重排(genome shuffling)在微生物遗传性状改变上的优点已经充分地显示出其在微生物育种上的应用价值。在对微生物遗传特性尚未完全掌握的今天，基因组重排技术在无需了解微生物遗传性状的条件下即能实现微生物的定向育种，获得正向突变的菌株，使之成为一种极其高效的微生物育种方法［3，4］。近年来，基因组重排已经成功地应用于快速提高弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的泰乐星的产量［5］和乳酸杆菌的耐酸性能［6］。本文以褐黄孢链霉菌为产生菌，通过对原生质紫外线诱变、链霉素抗性筛选和基因组重排等手段选育纳他霉素高产菌株。
1 材料与方法
1.1 菌种
出发菌株褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvos?poreus)SG?1。
1.2 培养基
斜面培养基、种子培养基和发酵培养基均参照［7］；再生培养基为R5培养基［8］。
1.3 培养条件
斜面培养条件、种瓶及发酵培养条件均文献［7］。
1.3 溶剂
P缓冲液参照文献［8］；TES缓冲液参照文献［9］；溶菌酶溶液是将溶菌酶0.2g溶于100ml P缓冲液中，使用前过滤除菌。
1.4 原生质的制备
将培养2d的种子液按10%的接种量转接于含有0.5%甘氨酸的种子培养基中培养1d，取培养液10ml，置无菌离心管内，4000r/min离心10min，弃上清，菌丝重新悬浮于5ml P液中，离心(4000r/min，10min)，弃上清；重复上述洗涤、离心操作，将菌丝悬浮于5ml 0.2%溶菌酶中，恒温30℃ 1h。用装有无菌脱脂棉的漏斗过滤，滤液3000r/min离心5min，弃上清，将原生质体悬浮于5ml P液中［9］。
1.5 紫外线诱变时间的确定
将装有制备好的S.gilvosporeus SG?1原生质体悬浮液的培养皿置磁力搅拌器上，放于距紫外光灯30cm处，在黑暗的条件下用紫外线照射不同时间。每个时间梯度吸取1ml菌液，经P液适当稀释，吸取0.5ml涂布于再生培养基上。黑布包扎，28℃避光培养10d左右。统计菌落数，致死率。记录未长菌落的紫外线光照时间，确定最短致死时间。
1.6 链霉素对S.gilvosporeus SG?1的MIC确定
S.gilvosporeus SG?1原生质体悬浮液经稀释后分别涂布于含有不同浓度链霉素的再生培养基平板上，28℃培养8～10d。观察不同平板上的菌落生长情况，记录未长菌落的链霉素最低作用浓度，即确定为链霉素对该菌的最小抑制浓度(MIC)。
1.7 原生质体融合
将链霉素抗性菌株制备成原生质体悬液，各取1ml置离心管中，2000r/min离心5min，去上清，加入40%的PEG 6000 5ml，振荡以悬浮原生质体，25℃保温5min后除去PEG，再用P液稀释涂布于再生培养基上，28℃培养8～10d［9］。
1.8 分析方法
1.8.1 菌体干重(DCW)的测定 准确量取10ml发酵液，6000r/min离心10min，收集沉淀，用无菌水清洗两次后，在100℃烘箱中干燥至恒重，称量并计算菌体干重。
1.8.2 还原糖的测定 采用3，5二硝基水杨酸法(DNS法)［10］。
1.8.3 氨基氮的测定 氨基氮测定采用甲醛法［11］。
1.8.4 纳他霉素产量的测定 采用HPLC外标法检测［12］。色谱工作条件为色谱柱：Hypersil BDS C18(416mm×200mm，5μm)；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸(60∶40∶5，体积比)；流速1.0ml/min；波长302nm；进样量20μl；灵敏度0102 AUFs；柱温为室温。
2 结果
2.1 紫外线诱变时间的确定
紫外线致死曲线见Fig.1。由于现在紫外诱变育种一般都采用较低剂量，以获得较高的正突变率。根据紫外线致死曲线，采用80%的致死率所对应的诱变剂量，即用功率为15W的紫外灯，照射距离为30cm的条件下，用紫外线照射40s。
2.2 链霉素抗性菌株的选育
链霉素对出发菌株S.gilvosporeus SG?1的最小原生质体抑制浓度为0.4μg/ml。将经过紫外线诱变的S.gilvosporeus SG?1原生质体溶液分别涂布于含有0.4μg/ml链霉素的再生平板上筛选链霉素抗性菌株，共分离了132株链霉素抗性菌株，通过摇瓶发酵分别测定纳他霉素的产量。其中有15株纳他霉素产量高于出发菌株，结果见Tab.1。
从Tab.1可以看出，经紫外线诱变后筛选链霉素抗性菌株正突变率达到11%左右，其中Strr?89达到了2468mg/L，为出发菌株SG?1的142%。对这15株抗性菌株进行两次复筛，选出4株纳他霉素产量较为稳定的突变菌株Strr?69(2364mg/L)、Strr?89(2468 mg/L)、Strr?111(2433mg/L)、Strr?129(2398mg/L)。
2.3 基因组重排选育高产菌株
将4株链霉素抗性菌株(Strr?69、Strr?89、Strr?111、Strr?129)作为亲本，制备原生质体，进行多亲本原生质体融合，并在再生平板上培养，培养后在再生平板上长出再生菌落(该再生菌落包括融合体和亲本)。将这些再生菌落混合制备原生质体，并进行原生质体融合后培养到再生平板上，从再生平板上共分离了87株再生菌株，通过摇瓶发酵，筛选出14株正突变菌株，结果见Tab.2。
从Tab.2中可以看出，通过基因组重排育种有16%的重排菌株为产量提高的菌株，其中菌株GS?74纳他霉素产量达到3774mg/L，比产量最高的亲本菌株Strr?89提高了52.9%，较原始菌株SG?1提高了1.17倍。
用群体传代的方法考察高产重排菌株GS?74的斜面传代稳定性，反复传代5代，纳他霉素产量依次为3774、3743、3702、3814和3753mg/L，稳定在3700～3800mg/L之间，表明该重排菌株的高产性状遗传特性较稳定。
2.4 高产重排菌株GS?74与出发菌株SG?1的菌落形态比较
重排菌株GS?74和出发菌株SG?1的孢子经稀释后，分别涂布到平板培养基上，培养7d观察菌落形态，结果如Tab.3所示。
2.5 重排菌株GS?74的生化特性
将重排菌株GS?74在3L发酵罐上进行发酵试验，在发酵培养不同时间，分别取样测定菌体干重、pH值、溶解氧(DO)、还原糖含量、氨基氮含量及发酵效价，结果如Fig.2所示。
Fig.2显示，在发酵前期，pH急速变化，在中后期，pH基本保持在6.0～7.3。0～12h是菌体的生长的延迟期，菌体数几乎不增长；12～60h是对数生长期，这段时期菌体高速生长，糖氮消耗较快；之后60～96h是稳定期和衰亡期，菌丝浓度增加缓慢，96h以后开始下降，在对数生长期后期和稳定期次级代谢产物纳他霉素大量积累，到120h纳他霉素产量达到最高，达到了3769mg/L。
3 讨论
基因组重排采用多亲本循环原生质体融合技术对微生物整套基因组进行重排。循环原生质体融合产生同源重组的几率要比常规原生质体融合高得多，能产生各种各样的突变组合，达到快速进化微生物表型的目的［5，6，13］。基因组重排将微生物整套基因组视作一个单元进行重排有利于微生物次级代谢产物产生菌的遗传改造。因为虽然微生物次级代谢产物的生物合成基因常常以基因簇的形式出现，但也有一些微生物次级代谢产物的生物合成基因分散排列，还有一些微生物1: pH; 2: DO; 3: DCW; 4: NH2N; 5: Reduced sugar; 6: Natamycin concentration
次级代谢产物的生物合成基因大部分成簇排列，少数基因排列在基因簇以外。此外，控制结构基因表达的调节基因则常常位于生物合成基因簇外或质粒上。另外，基因组重排技术无需了解微生物的代谢途径、编码生物合成酶的基因以及基因表达调控的知识，因此尤其适用于在微生物次级代谢产物产生菌的遗传改造。
如Fig.3所示，本文以S.gilvosporeus SG?1原生质体经紫外线诱变后筛选得到的4株链霉素抗性高产菌株作为亲本菌株，进行基因组重排育种，筛选得到了1株高产重排菌株S.gilvosporeus GS?74，其纳他霉素产量为3574mg/L，比原始出发菌株SG?1提高了1.17倍，充分显示了基因组重排育种的优越性。相对经典诱变育种，基因组重排育种的正向突变频率及正向突变的速度有显著的提高。也就是说，在工作量没有增加的前提下，基因组重排育种获得高产菌株的机会明显增大，极大地提高了微生物育种的效率。
Fig.3 Comparsion of natamycin?production among
the original strain, the streptomycin?resistant
muant, and the shuffled strain
【】
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