苦荞籽壳中黄酮类化合物的定性定量研究
【摘要】 目的:建立苦荞籽壳黄酮类化合物的定性和含量测定方法。方法:用薄层色谱法对苦荞中主要黄酮类化合物芦丁和槲皮素进行定性鉴别，并用紫外分光光度法对其进行总黄酮含量测定。结果:TLC定性鉴别能检出供试品中槲皮素和芦丁;总黄酮含量在4.32×10-3～2.59×10-2mg·mL-1范围内线性关系良好，平均加样回收率99.7%，RSD为0.21%。结论:色谱分离良好，斑点清晰可见，提示该方法简便可行，准确度和精密度均能满足分析要求。
【关键词】 苦荞籽壳; 黄酮类化合物; 定性分析; 定量分析; 薄层色谱法; 紫外分光光度法
苦荞麦为蓼科荞麦属植物，别名乌麦、花荞等。《本草纲目》记载:苦荞麦性味苦、平、寒，有益气力、续精神、利耳目、降气宽肠健胃的作用。苦荞主要分布在西北、东北、华北以及西南一带高寒山区。苦荞中含有丰富的蛋白质、脂肪酸及维生素，苦荞维生素的独特之处是含有大量的黄酮类物质，其中主要是芦丁，约占80%左右。几年来的研究表明，芦丁等黄酮类化合物对加强毛细血管和调节其渗透性，改善心血管系统，抑制恶性肿瘤生长及癌症，抗糖尿病，消炎，溃疡以及对呼吸道系统疾病等有良好的作用。本试验采用TLC对苦荞籽壳提取物进行定性鉴别，并用紫外分光光度法对其中总黄酮进行含量测定，为苦荞的开发和利用奠定基础。
1仪器与试剂
1.1仪器756型紫外-可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）;恒温水浴锅（北京市医疗设备总厂）;旋转蒸发仪（北京市医用仪器厂）;美国Waters公司真空脱气过滤装置。
1.2试药苦荞籽壳:广灵苦荞，由山西省农科院小杂粮室提供，种 子干燥样品经粉碎过筛后的苦荞籽壳;芦丁对照品:上海试剂二厂，Sigma进口分装;槲皮素对照品:药品生物制品检定所;其余试剂均为分析纯。
1.3样品的制备准确称取苦荞籽壳粉碎样5g，滤纸包好，放入索氏抽提器，加入70%乙醇300mL抽提至回流液无色，过滤提取液，减压蒸馏至无醇味后，用乙醚萃取3次，萃取液旋转蒸发浓缩至剩少量液体后冷冻干燥，得黄绿色粉末（为苦荞黄酮提取物）。所有溶剂都要经过脱气处理。
2定性鉴别
2.1溶液的配制
2.1.1对照品溶液 分别称取芦丁和槲皮素对照品适量，甲醇溶解，制成浓度为2mg·mL-1的对照品溶液。
2.1.2供试品溶液 取“1.3”项下苦荞黄酮提取物5mg， 置25mL容量瓶中，加甲醇适量，振摇使完全溶解并定容至刻度，作为供试品溶液待用。
2.1.3阴性对照液 取不含芦丁和槲皮素的提取物，按 “2.1.2” 项下方法制成阴性对照液。
2.2薄层色谱
照薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VIB）分别吸取芦丁和槲皮素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液4种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯 甲酸 蒸馏水（8:3:1）为展开剂，展至薄膜上边缘约0.5cm处，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，待乙醇挥干后，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无相同斑点显现。
3总黄酮含量测定
3.1溶液的配制
3.1.1对照品溶液 精密称取芦丁对照品（120℃干燥至恒重）10.8mg， 甲醇溶解完全后，移入50mL容量瓶中，用甲醇定容，配成浓度为0.216mg·mL-1的对照品溶液。
3.1.2供试品溶液 取“1.3”项下苦荞黄酮提取物10mg， 置250mL容量瓶中，加甲醇适量，振摇使完全溶解并定容至刻度，作为供试品溶液待用。 3.1.3测定方法 精密吸取样品溶液1mL于10mL容量瓶中，加入0.5mL0.5%亚硝酸钠，摇匀，放置6min;加 0.5mL 10%硝酸铝，摇匀，放置6min;加2mL4%氢氧化钠，甲醇定容至10mL，摇匀，放置15min。以甲醇为参比，在510nm处用紫外可见分光光度计进行测定。
3.2测定波长的选择精密吸取“3.1.1”项下对照品溶液，按“3.1.3项下溶液处理方法，以甲醇为参比，用紫外分光光度计，1cm比色皿在350～600nm波长范围内扫描，测定吸收度。在510nm处有最大吸收，故选择510nm为测定波长。
3.3线性关系考察准确量取“3.1.1”项下芦丁对照品0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0， 1.2mL，按“3.1.3”项下方法操作，于510nm处测定。以吸收度 A对浓度C绘制标准曲线。得到芦丁的回归方程为:A=2.674C-0.016 r=0.9997芦丁的线性范围为4.32×10-3～2.59×10-2mg·mL-1。
3.4精密度试验按“3.1.2”项下制备供试品溶液，按“3.1.3”项下方法测定5次，结果RSD为0.86%。
3.5稳定性试验对同一供试品溶液，在3h内每隔20min按“3.1.3”项下方法测定1次，吸收度基本不变，RSD为0.82%（ n =9），表明供试品溶液在3h内稳定。
3.6重复性试验取同一批苦荞籽壳共5份，每份5g，按“1.3”项下方法得到苦荞黄酮提取物后，按“3.1.2”项下方法配成供试品溶液，按“3.1.3”项下方法分别进行5次独立测定，记录吸收度。结果表明提取物中的总黄酮含量差异小，重复性好，RSD为 0.86% （ n =5）。
3.7加样回收率试验取已测含量苦荞籽壳样品3份，每份5g，按“1.3”项下方法操作，取其粉末5mg，分别准确加入芦丁对照品2.48mg，按“3.1.2”项下方法制备所需溶液，按“3.1.3”方法于510nm波长处测定吸收度。平均回收率为99.7%，RSD为0.21%。
3.8样品含量测定分别精密称取3份苦荞籽壳样品，按“1.3”项下方法提取，并按“3.1.2”项下方法制备样品溶液，“3.1.3”项下方法于510nm处测定，总黄酮的平均得率为39.5 mg·g-1，RSD为0.24%。
4讨论
通过薄层层析的分析，可知提取物中主要含有芦丁和槲皮素两种黄酮类化合物。根据报道，有关总黄酮测定的方法有Davis法、薄层扫描法、PR-HPLC法、重量法、荧光法、分光光度法、极谱法、毛细管电泳法等。目前对于总黄酮含量测定尚无统一的标准方法，本研究采用比较常用的分光光度法，其机理是黄酮类化合物的C3和C5位羟基或邻二酚羟基可与金属离子（Al3+）形成黄绿色络合物，通过氢氧化钠显色后在510nm处有一吸收峰，因此能够进行比色测定。在所测试浓度范围内线性关系良好，准确度和精密度均能满足分析要求。
